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多元实时 PCR 实验
试剂、试剂盒 PCR Super Mix-UDGROX 染料蒸馏水反向引物正向引物
仪器、耗材 ABIPrism7700型号系列检测系统
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
以50ul反应体系为例。
Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG(Invitrogen11730-025) 25ul
ROX染料(Invitrogen12223012) 1ul
灭菌的蒸馏水(Gibco15230-162) 10ul
10umol/L反向引物I 1ul
10umol/L正向引物I 1ul
10umol/L反向引物II 1ul
10umol/L正向引物II 1ul
小计 40ul
溶于0.1XTE或无菌水的模板 10ul
总计 50ul
2. 专门的仪器
ABIPrism7700型号系列检测系统。
二、方法
1.PCR循环时的温度条件与方案2相同
典型的多元扩增结果见图15-3(见封二彩图)。实验以白介素-4 为目的基因,以肌动蛋白基因(看家基因)为参照基因。结果表明,当β-肌动蛋白基因为 106 拷贝数时,对白介素-4 的定量范困为 22~3X15 拷贝。对 PCR 条件没有进一步优化,体系中试剂的浓度与一元扩增时的完全相同。以防实时 PCR 效率下降,可以按照下面步骤对 PCR 体系进行优化。
2. 优化多元反应的条件
a. 对于高风度基因(特别是看家基因)其引物浓度可以降低到其他基因引物浓度 1/4。
b.MgCl2 浓度从 3 mmol/L 升到 6 mmol/L。
c. 每种 dNTP 浓度提高到 400umol/L。
d. 聚合酶的酶量加倍(反应体系中每 1ul 为 0.06U)。也可以使用 PlatinumTaqDNA 优质聚合酶(Invitrogen10966-018)。