试剂、试剂盒 ddH20Vent 缓冲液Vent DNA 聚合酶dNTP引物质粒 DNA

仪器、耗材 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备热循环仪

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH20

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

引物，可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA(见下面第 1 步）

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭 (见第 5 步）

热循环仪

二、方法

1. 在细菌中扩增后，用随机多肽文库制备的质粒进行下面的反应。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10X Vent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH20 定容至 50ul

下面的各种质粒载体，应该分别进行反应：

表达载体，没有文库 DNA 插入

DNA 文库的混合物

少量 DNA，由 DNA 文库的单个细菌克隆制备

2. 在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3. 按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

将最后一个循环的延伸时间延长至 30s。

4. 冷却至 4°C。

5. 取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brook and Russell 2001)

三、分析

在图 26-4 所示的例子中，用 12 个核苷酸的随机文库混合物作为模板，分析 PCR 产物显示，

文库的大部分都含有正确大小的插入（图 26-4，第 2 泳道）。而且，检测不到与原始载体对应的 PCR 产物（比较图 26-4 第 1 泳道和第 2 泳道）。用 PCR 分析随机选择的文库中的单个克隆，证实绝大部分插入片段大小是正确的，而且文库中没有原始载体的污染（图 26-4，第 3~20 泳道）。分析 DNA 的序列证实，这些 PCR 产物正是 12 个核苷酸随机文库的正确成员（数据没有列出）。因此，对反应中间产物（方案 2 图 26-3) 进行 PCR 分析后估计，已经获得了高质量的最终文库（图 26-4)。