试剂、试剂盒 溶液与缓冲液LoTEcDNA标签连接酶

仪器、耗材 试剂盒PCR仪

实验步骤

一、在pZero的I位点连接串联体

1.SphI酶切载体，与按大小回收的串联体片段连接；我们推荐在pZero的Sph1位点上克隆串联体，有关于在此载体上克隆的细节我们参考了Zero Background 克隆试剂盒的使用手册：

2.在16℃ 下孵育过夜。

3.以LoTE扩增体积到200ul。

4.等体积的PCI进行抽提（实验方案A, 第2步)。

5.入下列物质沉淀水相：

6.4°C 下，在微离心机中以13000r/min离心15 min。

7.冲洗沉淀物4次（！！！），然后瞭干。

8.重悬于4ul 的 LoTE中。

9.用1ul连接混合物来转化ELECTROMAXDHlOB 细胞。

二、电穿孔

可应用任何转化方法，我们推荐使用电穿孔法是由于它与感受态ELECrR0MAXDHlOB 细胞结合转化效率很高（>1010 转化体/ug 质粒)。

1.在冰上融化 100ul的 ELECTROMAX DH10B细胞。

2.同时在冰上冷却所需数量的电穿孔小杯。

3.融化后，立即对 ELECTROMAXDH10B细胞进行下一步操作，将其分为每份 35ul（冰上操作)。

4.向 35ul—份的细胞中加入 ImI 的连接产物，轻叩试管使其混合。

5.移入冷却好了的小杯中，将细胞移至小杯的电极间，然后保存于冰上。

6.用下述设置在 GenePulserD 上电穿孔：

7.应用这个脉冲后，立即加入 965ulSOC 介质。

8.在 37°C下孵育 Ih。

9.含有抗生素 Zeocin 的LB 板上用 50ul 或 IOOul 铺板。

注意：有关板和 SOC 介质的详细情况在 ZeroBackground克隆试剂盒的使用手册中有详尽描述。

10.37°C 的恒温箱内将铺好的板过夜孵育。

11.第二天这些板上应含有数百个克隆。