实验材料 基因组DNA

试剂、试剂盒 PCR 混合液

仪器、耗材 96孔透明板和盖子水平离心机ABI PRISM 7700 测序系统热循环仪统计软件包

实验步骤

1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因组DNA，保留A行作对照—其中4孔只加2ul缓冲液作为「无 DNA」对照，余下8孔每孔加24基因组DNA作为阳性对照，两种纯合子各加4孔。

2.每孔加23ul PCR混合液，盖上透明盖，在水平离心机上短暂离心，用ABI PRISM 7700测序仪得到一个PCR反应前荧光读数。使用「PlateRead」形式，确保选中Use Spectral Compensation forEndpoint 项（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜单下）。

3.用下面的条件在热循环仪上开始PCR。

1个循环：2 min 50°C

1个循环：10min 95°C(变性）

40个循环：15s 94°C(变性)

1 min 62°C(复性/延伸)

最终步骤：无限4°C(维持）

4.再次读取荧光得到一个PCR反应后读数。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)软件，选用「AUelicDiscrimination」模式读取焚光，通过算法可以自动分出基因型或通过视觉检查进行基因分型。

如果进行大规模基因分型（如样本数>500)，将多个孔板的样本数据集中起来确定基因型显得更为准确。这样，请遵照本方案中的剩余步骤。

5.将原始数据（含 PCR 前和 PCR 后的）从孔板读数形式导入统计软件包。用如下方式计算标准化的荧光值：（报道荧光值一背景）/(参照荧光值一背景）；报道荧光在 FAM 和 VIC 道，参照荧光在 ROX 道。

6.用一种非参数的测试（如 Kruskal-WaUis 测试）比较孔板之间每一种报道染料的平均 PCRhli 标准灭光。如果一块孔板（或一组孔板）的 pcR 前突光显著的不同于其他孔板，则相应的调整 PCR 后荧光值。例如，某一特定孔板的 FAM 报道染料的平均荧光是其他孔板的 1.5 倍，则该板每一孔的 PCR 后 FAM 荧光值除以该因数。

7.使用逐步聚类分析（K-meansclustering) 自动将已校正的 PCR 后数据分成 4 组—3 个基因型和 1个「无DNA」对照。大多数统计软件包提供了可以直接使用的聚类分析算法。

通常，聚类是明显的而无需进一步处理。为确定基因型分配是否有意义，检查数据的散点图很重要。例如，极端值会破坏聚类分析算法而产生明显错误的分类结果。去除这种极端值通常就有正确的分类结果。