实验材料 遗传修饰细胞的培养成年宿主小鼠聚烯吡酮磺溶液

试剂、试剂盒 麻醉剂

仪器、耗材 小鼠大脑图片集耳打孔器带有电极操作的脑定位支架以及汉密尔顿注射夹外科用具bulldog 磁夹海绵中号镊子伤口夹26G针汉密尔顿注射器

实验步骤

1.为移植开始培养基因修正的细胞，收获 80%~90% 的汇合度的细胞。手术时，当麻醉和准备动物的时候准备好悬浮细胞（支持方案）。手术期间，每 30~60 min 重悬细胞。

2.参考鼠脑图像决定注射位置，通过 anterior-posterior 和 medial-lateral 坐标假定脑功能区定位支架的前肉点，通过垂直坐标假定硬脑脊膜。

3.麻醉一个成年的宿主，注射 0.25 ml 麻醉液，每 160 g 体重和标记动物加 1 个耳打孔器或耳标。

4.放置好一个麻醉小鼠在一个脑功能区定位区域。以维持啮鼠动物脑在正确的位置，插人耳棒，小心在计算好的刻度上系紧。准确放置口棒。

5.在皮肤上开个小口，位于眼耳中线。用 10 号解剖刀分开皮肤并清洁皮肤，去除血和粘连组织。

6.确定前肉点，确定坐标，在头盖骨上开一个 1mm 直径的孔，用 26G 针切除硬脑脊膜。

7.用吸管轻轻吹打以重新分开细胞悬液。吸 1~3ul 75000~300000 个细胞每注射点。在脑功能区定位支架上装好带有 5ul 汉密尔顿注射器的电操纵器，并避免气泡。

8.轻轻注射溶液，并使注射速度低于 1ul/min。当注射完毕时，抬起针头 1 mm，静置 2 min，收针。

9.如果多于两个注射点，在新坐标上再打一个 1 mm 直径的孔，重复注射操作。避免每只小鼠注射量大于 10ul。

10.拿开小鼠，清洁头盖骨，用抗菌素消毒。用伤口架子夹紧皮肤，把动物转移至恢复笼子。